Strukturbiologische und mechanistische Untersuchungen zur Erkennung und Reparatur von DNA-Photoschäden

Es ist bekannt, dass der UV-Anteil des Sonnenlichts zur Schädigung der DNA und zurAusbildung einer Vielfalt an DNA-Photoschäden führt. Die dabei entstehenden cytotoxischenund mutagenen Schäden sind Cyclobutanpyrimidindimere (CPD-Schäden), (6-4)-Photoschäden, als auch dessen Dewar Valenz-Isomere. Heutzutage besteht kein Zweifeldaran, dass diese Schäden eng mit dem Auftreten von Hautkrebs in Verbindung stehen. Umsich vor den negativen Auswirkungen der Photoschäden schützen zu können, haben sich alledem Sonnenlicht ausgesetzte Lebewesen im Laufe der Evolution ein multifunktionelles undeffizientes Reparatursystem angeeignet. Hier wären zum Beispiel die Exzisionsreparatur vongeschädigter DNA und die direkte Reversion der Schäden zu nennen. Die letztgenannte Formder Reparatur nennt man Photoreaktivierung und wird der Enzymklasse der Photolyasenzugeschrieben. Diese Photolyasen sind paradoxerweise in der Lage, mit Hilfe von UV-A/Bbzw.Blaulicht (300 - 500 nm), Pyrimidindimere wieder in ihre intakten Basen umzuwandeln.Die Photolyasen sind hochselektive Enzyme und lassen sich je nach Substratspezifität inCPD- und (6-4)-Photolyasen unterteilen.In den letzten Jahren hat sich der CPD-Schaden zusammen mit der CPD-Photolyase alsModellsystem bei der Untersuchung zur Entstehung und Reparatur von DNA-Photoschädenentwickelt. So sind zum Beispiel der Reparaturmechanismus sowie die Cofaktoren-Zusammensetzung der CPD-Photolyasen weitestgehend geklärt. Im Gegensatz dazu weiß manvergleichsweise wenig über die (6-4)-Schäden und ihre Photolyasen. Aufgrund derÄhnlichkeit zu den CPD-Photolyasen, wurde für die (6-4)-Photolyasen ein ähnlicherReparaturmechanismus postuliert, wobei jedoch der dabei auftretende viergliedrigeÜbergangszustand (ein Oxetan- oder Azetidin-Intermediat) experimentell nicht nachgewiesenwerden konnte.Um speziell diese als auch weitere Fragen bezüglich der (6-4)-Schadenserkennung undReparatur durch die (6-4)-Photolyasen klären zu können, musste der (6-4)-Schaden inausreichenden Mengen für biochemische und strukturbiologische Experimente synthetisiertwerden.Im Rahmen dieser Arbeit konnte schließlich eine Methode optimiert werden, mit der mandurch direkte Belichtung von Oligonukleotiden bei 254 nm unter Auschluss von Sauerstoff,ausreichende Mengen an (6-4)-Schaden enthaltener DNA isolieren konnte.Die Kristallstruktur des T(6-4)T-Schadens im Komplex mit der (6-4)-Photolyase aus D.melanogaster konnte mit einer Auflösung von 2.0 Ĺ erhalten werden und zeigte eine fürPhotolyasen typische Architektur mit einer N-terminalen /-Domäne, einer C-terminalen -helikalen Domäne sowie einem Interdomänen-Loop. Die DNA wird bei der Bindung durchdie (6-4)-Photolyase vollständig geöffnet und der Schaden um nahezu 180 ° in die aktiveTasche des Enzyms gedreht. Nach Reduktion mit Natriumdithionit und Belichtung mitWeißlicht konnte die Reparatur auch im Kristall durchgeführt und die entsprechende Struktur(2.7 Ĺ) mit den intakten Basen im aktiven Zentrum erhalten werden (Abbildung 2b). Eineweitere Struktur (2.9 Ĺ) mit dem T(6-4)C-Schaden im Komplex mit der Photolyase zeigteeine ähnliche Struktur verglichen mit dem T(6-4)T-Schaden auf.Anhand der erhaltenen Strukturdaten und weiteren Mutationsstudien konnte nachAktivitätsbestimmungen der einzelnen Mutanten die katalytisch essentielle Triade His365-His369-Tyr423 charakterisiert werden (siehe Abbildung 2), wobei ebenfalls zwei Co-Kristallstrukturen der Mutanten H365N (3.2 Ĺ) und H369M (3.2 Ĺ) erhalten werden konnten.In keiner der Co-Kristallstrukturen konnten Hinweise auf den angenommenen viergliedrigenÜbergangszustand gefunden werden, so dass unter Einbeziehung der Mutationsstudien einneuer Reparaturmechanismus postuliert wurde. Als zentrales Intermediat wird hierbei einRadikal am C5 des Pyrimidinrings postuliert, wobei diese These durch Reparaturexperimentemit einem U(6-4)T-Schaden weiter gestützt werden konnte.Durch die Verwendung des modifizierten T(6-4)C*-Schadens und der folgendenUmwandlung in den T(Dew)C*-Schaden, konnte zudem erstmals experimentell nachgewiesenwerden, dass die Reparatur der Dewar Valenz-Isomere über die entsprechenden (6-4)-Schäden als Intermediat verläuft. Durch Reparaturexperimente mit der H365N Mutante undder oxidierten Form der (6-4)-Photolyase konnte diese Isomerisierung als einElektronentransfer katalysierter Prozess identifiziert werden. Die in diesem Zusammenhangerhaltenen Co-Kristallstrukturen des T(6-4)C*- (2.0 Ĺ) und des T(Dew)C*-Schadens (2.3 Ĺ)zeigten dabei keine großen Änderungen zu dem unmodifizierten T(6-4)C-Schaden auf.Nach den strukturbiologischen und mechanistischen Untersuchungen konnte schließlich nochdie Frage des zweiten Cofaktors der (6-4)-Photolyase aus D. melanogaster geklärt werden.Rekonstitutionsversuche mit den vier in Frage kommenden Cofaktoren FAD, FMN, MTHFund F0 haben dabei in UV- und Fluoreszenzmessungen gezeigt, dass nur das F0 von demEnzym gebunden wurde. Aktivitätsstudien mit dem mit F0 rekonstituierten Enzym habendabei einen Anstieg der Reparatur um den Faktor 5 ergeben, wobei ebenfalls eineKristallstruktur mit dem gebunden Cofaktor erhalten werden konnte (2.1 Ĺ). Der Cofaktorkonnte zusätzlich durch Extraktion direkt aus Fruchtfliegen in D. melanogaster nachgewiesenwerden.